Spektrofotomeetriline kolorimeetriline valgu kvantifitseerimine
Valgud on tavaliselt valkude segu. Kolorimeetrilised testid põhinevad valgu koostisosadel: Aminohapped (nt türosiin, seriin) reageerivad täiendava kromogeense rühma või värviga, et toota värvilist materjali. Värvilise materjali kontsentratsioon on otseselt seotud reageeriva valgu aminohapete arvuga, mis peegeldab valgu kontsentratsiooni.
Kolorimeetriline meetod
On mitmeid meetodeid nagu BCA, Bradford ja Lowry.
Lowry meetod: põhineb kõige varem Biureti reaktsioonil ja paranenud. Valge reageerib Cu2-ga, et saada sinist reaktsiooni. Kuid Lowry meetod on tundlikum kui Biuret. Puuduseks on vajadus järjestikku lisada mitu erinevat reagenti; reaktsioon võtab kaua aega; on mittesuguliste ainete suhtes vastuvõtlik; Valgud, mis sisaldavad EDTA-d, Triton x-100 ja ammoniaarsulfaati, ei sobi selle meetodi jaoks.
Bicinhoniniinhappe analüüs: see on uuem, tundlikum valguproov. Analüüsitav valk reageerib Cu2-ga leeliselises lahuses, et saada Cu, mis moodustab BCA-ga kelaadi, et moodustada lilla ühend, mille absorptsiooni tipp on 562 nm. Selle ühendi ja valgu kontsentratsiooni vaheline lineaarne suhe on tugev ja pärast reaktsiooni moodustunud ühend on väga stabiilne. Lowry meetodi puhul on toiming lihtne ja tundlikkus on kõrge. Kuid sarnaselt Lowry meetodiga on see vastuvõtlik valkude ja puhastusvahendite häirimisele.
Bradfordi meetod: selle meetodi põhimõte on see, et valk reageerib Coomassie Brilliant Blue'iga, et saada värviline ühend, mis imendub lainepikkusel 595 nm. Selle suurim omadus on selle tundlikkus, mis on 2 korda madalam kui Lowry ja BCA puhul. See on lihtsam ja kiirem. Selleks on vaja ainult üht tüüpi reaktsiooni reagenti. Selle tulemuse hõlbustamiseks võib ühend olla stabiilne 1 tunni jooksul; Madala interferentsiga BCA reageerib redutseerivate ainetega (nt DTT, merkaptoetanool), mis sobib kokku. Siiski on see detergentide suhtes endiselt tundlik. Peamiseks puuduseks on see, et erinevad standardid võivad viia ühe ja sama valimi tulemuste suured erinevused ja võrreldavaid tulemusi.
Mõned teadlased, kes puutuvad kolorimeetriliste mõõtmistega esimest korda kokku, võivad segada erinevate kolorimeetriliste testide tulemustega. Milliseid meetodeid te arvate segaduses? Tulenevalt asjaolust, et rühmad reageerisid erineval viisil ja kromogeensed rühmad ei olnud ühesugused, kasutati sama proovi samaaegselt mitut meetodit, et muuta sama proovi proovikontsentratsioonid ebaühtlaseks. Näiteks Keller jt testiti proteiini inimese rinnapiima ja leidis, et Lowry ja BCA-ga mõõdetud kontsentratsioonid olid oluliselt kõrgemad kui Bradfordil. Erinevus oli märkimisväärne. Isegi kui sama näidis määratakse, on sama kolorimeetrilise meetodi järgi valitud standardproov vastuolus ning kontsentratsioon pärast katset on samuti ebajärjekindel. Näiteks kasutage Lowry proteiini testimiseks raku homogenaadis, kasutades standardse BSA-d kontsentratsiooniga 1,34 mg / ml ja standardina globuliini kontsentratsiooniga 2,64 mg / ml. Seetõttu tuleb enne kolorimeetrilise meetodi valimist eelistada katsetatava proovi keemilist koostist ja leida keemiliselt sarnane standardvalk standardina. Lisaks sellele põhjustab valkude kvantifitseerimise kolorimeetriline meetod sageli probleeme, kuna proovi neelduvusväärtus on liiga madal, mille tulemusena suur erinevus mõõdetud proovikontsentratsiooni ja tegeliku kontsentratsiooni vahel. Põhiprobleemiks on see, et 1011 spektrofotomeetri, küveti olulise osa värvil on teatav poolväärtusaeg, nii et iga kolorimeetriline meetod loetleb reaktsiooni katseaja. Kõiki proove (sh standardproove) tuleb selle aja jooksul katsetada. Kui aeg on liiga pikk, saadakse neelduvus väärtus väiksem ja konverteeritav kontsentratsioon väheneb. Lisaks on kõik katset mõjutavad tegurid reaktsioonitemperatuur, lahuse pH väärtus jne. Peale selle on väga oluline kasutada plastmassi kolorimeetrit. Vältige kvartsist või klaasist valmistatud kveettide kasutamist, sest värv pärast reaktsiooni põhjustab kvartsi või klaasi värvi, mille tulemuseks on vale ebatäpsus.
Ettevõte on spetsialiseerunud spektrofotomeetrite müügile, teretulnud klientidele, kellel on vajadus konsulteerida ja osta, pakume teile siirast teeninduse ja kvaliteetseid tooteid ning madalamaid hindu.
E-post: info@sumerlab.com
Veeb: sumerinstrument.com