Sissejuhatus spektrofotomeetri üldpõhimõtetesse ja rakendamisse

Spektrofotomeetrit kasutatakse laialdaselt bioloogilistes, keemilistes, kliinilistes ja keskkonnauuringutes.
Spektrofotomeetria mõõdab, kui palju valgust kemikaal suudab neelata, läbides valguskiire läbi proovi spektrofotomeetris.
Avastatud valguse intensiivsuse mõõtmise abil saab meetodit kasutada lahustunud aine kontsentratsiooni määramiseks proovis.
Spektrofotomeetria mõiste
Proovile saadetud kiir koosneb footonkiirgust.
Kui footonid vastavad proovis olevatele molekulidele, suudavad molekulid neist mõnda absorbeerida, vähendada valgusvihu footonite arvu ja vähendada signaali intensiivsust.
Läbilaskvus on proovi läbiva valguse osa. See on määratletud kui proovi läbiva valguse intensiivsus langeva valguse intensiivsuse korral.
Neeldumine on vastupanu läbilaskvusele, mis vastab spektrofotomeetri abil mõõdetud kogusele.
Neelduvuse järgi saab lahuse proovi kontsentratsiooni määrata Lamberti arve alusel, mis näitab, et neeldumise ja proovi kontsentratsiooni vahel on lineaarne seos. Õlle Lamberti seaduse kohaselt on neeldumine neeldumisteguri korrutis, mis on kindla lainepikkuse korral lahustunud aine neeldunud valguse hulga ja valguse läbimise vahekorra mõõt. Proov või vahemaa ja lahustunud aine kontsentratsioon. Üldiselt on neeldumise mõõtmise eesmärk proovi kontsentratsiooni mõõtmine.
Spektrofotomeetri komponendid
Iga spektrofotomeeter koosneb valgusallikast, kollimaatorist (lääts või teravustamisseade tugevate ja sirgete kiirte edastamiseks), monokromaatorist erineva lainepikkusega kiirte eraldamiseks ning pikkusevalijast soovitud lainepikkusega laine või soone valimiseks. Selles videos esitatud spektrofotomeetris kasutatud valguse lainepikkus on ultraviolett- ja nähtava valguse vahemikus. Spektrofotomeeter sisaldab ka proovihoidjat, fotodetektorit ja detektori tulemusi kuvavat ekraani.
Viimane spektrofotomeeter on ühendatud otse arvutiga, kus saab katseparameetreid juhtida ja tulemusi kuvada.
Spektrofotomeetri tööpõhimõte
Spektrofotomeetria tegemisel on oluline võtta tarvitusele ettevaatusabinõud, näiteks kanda kindaid, sõltuvalt kasutatava bioloogilise või keemilise lahuse tüübist.
Enne proovi UV-vis-spektri mõõtmist lülitage seade sisse ja laske lambil ja elektroonikal kuumeneda.
Valmistatakse sama lahuse, sama pH ja sarnase ioontugevusega, kuid ilma analüüsitavate komponentideta pimeproov; kuna küvett ja lahusti suudavad valgust hajutada, on vaja proovi analüüsida.
Traditsiooniline spektrofotomeetri proovide hoidik on mõeldud plast- ja kvartskausside hoidmiseks. Pipeteerige algne lahus kaussi.
Pärast sõrmejälgede pühkimist ja kausi välisküljele pritsimist sisestage küvett õigesti proovihoidikusse ja sulgege kaane luuk.
Ärge unustage kunagi ukse sulgemist, sest avatud spektrofotomeetri UV-kiirgus võib kahjustada teie silmi ja nahka.
Programmeerige proovile edastatav lainepikkuse või lainepikkuse vahemik. See sõltub parimast lainepikkusest, mida analüüsitav komponent suudab neelata. Seejärel nullitakse pimeproovi mõõtmise teel masin, mis lahutab proovi puhverlahuse põhjustatud põhja neeldumise.
Sõltuvalt teostatava spektrofotomeetrilise katse tüübist võib enne proovi mõõtmist osutuda vajalikuks genereerida standardkõver, mille põhjal on võimalik proovis analüüsitud ühendi kontsentratsiooni määrata.
Laske proovil jõuda õige temperatuurini ja segage õrnalt, et vältida mullide teket. Proovi saab seejärel lisada otse masinas asuvasse kaussi ja seda saab lugeda.
Pärast proovi neelduvuse mõõtmist arvutatakse katse korralikult; näiteks kontsentratsiooni või ensüümi aktiivsuse taseme määramiseks.
Spektrofotomeetri rakendamine
Spektrofotomeetri üks levinumaid kasutusviise on rakkude tiheduse mõõtmine. Rakutiheduse mõõtmist saab kasutada bakterite logaritmilise kasvukõvera saamiseks, millest alates saab kindlaks määrata rekombinantse valgu integreerimise optimaalse aja.
Spektrofotomeetrit saab kasutada ka keemilise reaktsiooni kiiruse mõõtmiseks. Selles teostuses kasutatakse neelduvust ensümaatilise reaktsiooni jälgimiseks, mis aja jooksul kaob 452 nm vahepealse reaktsiooni kaudu. Selle ensümaatilise etapi kiirust saab arvutada, sobitades andmed vastava võrrandiga.
Mikrospektrofotomeetri kasutuselevõtt välistab proovihoidja vajaduse. Need spektrofotomeetrid kasutavad proovi säilitamiseks pindpinevust.
Mikrospektrofotomeeter on parim valik väikeste ja kallite proovide, näiteks biomolekulide, sealhulgas valkude ja nukleiinhapete massi ja kontsentratsiooni mõõtmiseks.
Valkude neeldumine 280 nm juures sõltub trüptofaani, türosiini ja fenüülalaniini aromaatsete külgahelate sisaldusest, samuti kahe tsüsteiini vahelisest disulfiidsidemest.
Valgu kontsentratsiooni saab määrata selle neeldumise järgi 280 nm juures ja neeldumisteguri järgi, mis põhineb aminohapete koostisel.
DNA ja RNA neeldumine on maksimaalne 260 nm, millest saab määrata nende kontsentratsioonid. Nukleiinhapete puhtust saab hinnata ka neeldumise näitude ja konkreetsete lainepikkuste suhte järgi.