Autoklaavi steriliseerimine hõlmab kolme erinevat etappi:
Õhu eemaldamine: selles algfaasis eemaldab autoklaav kambrist õhu. Vaakumpump imeb õhu välja, luues madala rõhuga keskkonna. See samm tagab, et aur tungib tõhusalt kõikidesse piirkondadesse ja jõuab nõuetekohaseks steriliseerimiseks koormani.
Steriliseerimine: kui õhk on eemaldatud, saavutab temperatuur autoklaavis õige taseme. Rõhu all tekkiv küllastunud aur tapab baktereid, viirusi ja muid mikroorganisme. Tavaline steriliseerimise temperatuur on 121 kraadi rõhul 1,1 kilogrammi ruutsentimeetri kohta (kg/cm²) (vastab 15 naelale ruuttolli kohta (lb/in²)). Autoklaavimise kestus varieerub sõltuvalt koormuse mahust, kuid üldiselt peetakse selleks 15-20 minutit.
Jahutamine/kuivatamine: Pärast steriliseerimist eraldub aur ja autoklaav jahtub. Kui temperatuur on ohutu, avatakse uks ja steriliseeritud esemed on kasutamiseks valmis.
Tõhus õhu eemaldamine, esemete õige paigutus ja piisav kuumutamisaeg on autoklaavi edukaks steriliseerimiseks üliolulised.