Spektrofotomeetrid on muutunud tänapäevasteks molekulaarbioloogia laborites. Sageli kasutatakse nukleiinhappeks, valgu kvantifitseerimiseks ja bakterite kasvu kontsentratsioonide kvantifitseerimiseks.
Spektrofotomeetri lihtne põhimõte
Spektrofotomeeter kasutab valgusallikat, mis võib tekitada mitmeid lainepikkusi ja läbib spektri spektroskoopilisi seadmeid, et genereerida teatud lainepikkusega valgusallikas. Pärast valgusallika läbimist katsetatavast proovist absorbeeritakse osa valgusallikast ja arvutatakse proovi neelduvus, muutes seeläbi proovi kontsentratsiooni. . Proovi neelduvus on proportsionaalne proovi kontsentratsiooniga.
Nukleiinhapete kvantifitseerimine
Nukleiinhapete kvantifitseerimine on spektrofotomeetri kõige sagedamini kasutatav funktsioon. Oligonukleotiide, üheahelalist, kaheahelalist DNA-d ja RNA-d saab puhvris kvantifitseerida. Nukleiinhappe kõrgeima absorptsioonipiigi absorptsioonipiik on 260 nm. Iga nukleiinhappe molekulaarne koostis on erinev, nii et konversioonitegurid on erinevad. Erinevate nukleiinhapete tüüpide kvantifitseerimiseks valige eelnevalt vastavad koefitsiendid. Näiteks 1 OD neeldumine vastab 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNA ja 30 μg / ml Olig. Pärast katse neeldumist konverteeritakse ülaltoodud koefitsientidega vastava proovi kontsentratsiooni saamiseks. Enne katsetamist valige õige protseduur, sisestage põhilahuse ja lahjendi maht ning seejärel kontrollige tühi ja proovilahus. Siiski ei olnud katse alati sujuv. Ebastabiilsed näidud võivad olla katsetaja suurim peavalu. Kõrgema tundlikkusega instrumendid näitavad suuremat neeldumist.
Tegelikult võimaldab spektrofotomeetri konstruktsioonipõhimõte ja tööpõhimõte neeldumist teatud vahemikus varieeruda, st instrumendil on teatud täpsus ja täpsus. Näiteks Eppendorfi biofotomeetri täpsus on ≤1,0% (1A). Selliste mitmekordsete testide tulemused varieeruvad vahemikus 1,0% keskmisest ja on normaalsed. Lisaks on vaja arvestada ka selle nukleiinhappe füüsikalis-keemilisi omadusi ja puhvri pH-d, milles nukleiinhape on lahustunud, ioonikontsentratsioon jne. Kui ioonide kontsentratsioon on katse ajal liiga kõrge, siis lugemise nihkeid, mistõttu on soovitatav kasutada teatud pH väärtust ja madalat ioonikontsentratsiooni. Puhvrid, nagu näiteks TE, stabiliseerivad näidud oluliselt. Proovi lahjenduskontsentratsioon on samuti tegur, mida ei saa eirata: mõnede peenosakeste, eriti nukleiinhappe proovide vältimatu esinemine proovis. Nende väikeste osakeste esinemine häirib testitulemusi. Selleks, et minimeerida osakeste mõju testitulemustele, peab nukleiinhappe neeldumine olema vähemalt suurem kui 0,1 A ja neelduvus on eelistatult vahemikus 0,1 kuni 1,5 A. Selle vahemiku piires on selle interferents. osakesed on suhteliselt väikesed ja tulemus on stabiilne.
See tähendab, et proovi kontsentratsioon ei tohiks olla liiga madal või liiga kõrge (väljaspool fotomeetri katseulatust). Lõpuks peaksid kasutustegurid, nagu segamine, olema piisavad, vastasel juhul on neeldumise väärtus liiga madal, isegi negatiivsed väärtused; segu ei saa eksisteerida mullid, tühjal vedelikul ei ole suspendeeritud ainet, vastasel juhul liigub lugemine drastiliselt; pimekatse ja proovi testimiseks tuleb kasutada sama küvetit. Vastasel juhul on kontsentratsiooni erinevus liiga suur; teisendustegur ja proovikontsentratsiooni üksus valitakse järjepidevalt; akna kulumise küvetit ei saa kasutada; proovi maht peab jõudma küvettiga nõutavale minimaalsele mahule.
Lisaks nukleiinhappekontsentratsioonile näitab spektrofotomeeter ka mitmeid väga olulisi suhteid, mis näitavad proovi puhtust, näiteks A 260 / A 280 suhet, mida kasutati proovi puhtuse hindamiseks, kuna valgu absorptsioonipiik on 280 nm. Puhas proov, mille suhe on suurem kui 1,8 (DNA) või 2,0 (RNA). Kui suhe on väiksem kui 1,8 või 2,0, näitab see valgu või fenoolsete ainete olemasolu. A 230 näitab, et proovis on mõningaid saasteaineid, nagu süsivesikud, peptiidid, fenoolid jne, ja puhtama nukleiinhappe A 260 / A 230 suhe on suurem kui 2,0. A 320 tuvastab lahuse hägususe ja muud häiretegurid. Puhaste proovide puhul on A 320 üldiselt 0.
Hangzhou Sumer Instrument Co., Ltd.
Lisa: No.168 Wuchang Ave., Yuhangi ringkond, Hangzhou 310023, Hiina
TEL: + 86-571-88739859
Telefon: +8618658504900
E-post: info@sumerlab.com
Veeb: sumerinstrument.com